SPERM HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ

Doğal ilişki ile döllenme sırasında sperm servikal mukus içerisinden geçerken seminal plazmadan fizyolojik bir filtrasyon ile ayrılır ve kadın üst genital traktüsüne erişir. Böylece motil spermler ovum ve fallop tüplerinin çevresine erişirken diğer seminal plazma bileşenleri alt genital kanalda kalır. Normalde doğal yolla gerçekleşen bu işlemin yardımcı üreme tekniklerinde ayrıca yapılması gerekir.

Sperm hazırlama, üreme hücrelerinin en iyi kaliteye ulaşmasını sağlamak için yapılan çeşitli laboratuvar işlemlerini ifade eder. Bu işlem, sperm sayısını, hareketliliğini ve yapısal bütünlüğünü optimize etmeye yönelik adımları içerir. Genellikle intrauterin inseminasyon (IUI), tüp bebek (IVF) ve mikroenjeksiyon gibi yardımcı üreme tekniklerinde kullanılır. Sperm hazırlama, döllenme başarısını artırmak için kritik bir adımdır.

Yardımcı üreme tekniklerinde kullanılan spermler

1-Masturbasyon yolu ile toplanan ejakülat: Sperm, erkeklerden yumurtaların toplandığı gün alınmaktadır. Doğru ve yeterli spermin elde edilebilmesi içinse erkeklerin toplama gününden 3-5 gün önce cinsel perhize girmesi tavsiye edilmektedir. Bu sayede çeşitli yöntemlerle elde edilen menide canlı hücreler daha fazla olmaktadır. Sayı ve motilite durumuna göre IUI, IVF ya da ICSI uygulanır.

2-Unejakulatuar hastalardan elde edilen ejakülatlar

-Retrograt ejakülasyon: Ejakülasyonun direkt olarak mesaneye olduğu bu durumda spesifik tedavi yoksa spermatozoalar masturbasyon sonrası idrardan elde edilir; sayı ve motilite durumuna göre IUI, IVF ya da ICSI uygulanır.

-Anejakulasyon: Akut erektil disfonksiyonlu bazı hastalarda sildenafil asetat kullanımı faydalı olabilir.   Nöropati ya da spinal kordon yaralanması olan IVF, ICSI gerektiren hastalarda penil vibrostimulasyon ya da elektrostimulasyon ejakülat elde etmede kullanılan yöntemlerdir.

3-Ejaküle olmayan spermatozoa

-Epididmal spermatozoa: Obstrüktif azoospermili,  cerrahinin başarısız olduğu ya da bilateral vaz deferens yokluğu gibi endikasyonunun olmadığı durumlarda mikrocerrrahi epididimal sperm aspirasyonu   (MESA)   ya da perkütanöz sperm aspirasyonu  (PESA)  gibi yöntemlerle toplanan spermatozoonlar ICSI için kullanılır.

-Testiküler spermatozoa:  Epididimal fibrozis gibi nedenlerle motil spermatozoa elde edilemediğinde testiküler sperm retrieval alternatif olabilir. Bunun için açık eksizyonel biyopsi   (testiküler sperm ekstraksiyonu-TESE),   perkütan sperm aspirasyonu (testiküler sperm aspirasyonu-TESA)   ya da ince iğne aspirasyonu gibi yöntemler kullanılır.  Azospermi ile sonuçlanan primer testiküler disfonksiyonlu olgularda aktif spermatogenezin bulunduğu birkaç seminifer tübül bulunabilir. TESE ve TESA yöntemleri benzer sonuçlara sahip olmakla beraber TESE ile daha fazla sperm elde edilir.

-İmmatür testiküler gametler: Spermatozoa elde edilemeyen azoospermik hastalarda uzun ve yuvarlak spermatid  kullanımı ile beraber gebelik oranları sınırlıdır.

Mikroenjeksiyon ya da IVF tedavilerinde döllenme sırasında kullanılan spermin elde edilmesini sağlayan tüm bu yöntemler sonrasında erkekler aynı gün taburcu olabilmektedir. Birkaç gün operasyon bölgesinde ağrı ve acı hissedilmesi normaldir.

KALİTELİ SPERMİN SEÇİMİNDE YÖNTEMLER

Yardımcı üreme tekniklerinde kullanılmadan önce semenin hazırlanması gerekir. Bu yöntemlerin hepsinde de seminal plazma ortamdan uzaklaştırılırken, motilitesi bulunmayan spermler ve lökositler elimine edilerek motil sperm seçimi yapılır. İyi kaliteli spermin seçiminde, hala basit yüzdürmeden (direkt swin-up) gelişmiş dansite gradient gibi klasik yöntemler kullanıldığı gibi geliştirilmiş olan ve hatta geliştirilen yeni yöntemler de ((MACS, IMSI, SPERM CHİP, PICSI vb.) mevcuttur.

SPERM YIKAMA METODLARI

Yardımcı üreme tekniklerinde kullanılmadan önce semenin hazırlanması gerekir. Bu yöntemlerin hepsinde de seminal plazma ortamdan uzaklaştırılırken, motilitesi bulunmayan spermler ve lökositler elimine edilerek motil sperm seçimi yapılır.

Yardımcı üreme tekniklerinde kullanılan sperm hazırlama yöntemlerinin amacı

• Sperm hücrelerinden seminal plazmanın uzaklaştırılması
• Prostaglandin ve diğer inhibitör maddelerin spermden uzaklaştırılması
• Toksik bioaktif maddelerin (ROS-serbest oksijen radikalleri gibi) uzaklaştırması
• Olgun olmayan sperm (immatür germ) hücrelerinin, lökositlerin ve epitel hücrelerinin ortamdan uzaklaştırılması
• İleri hızlı hareketli (progresif-hareketli) ve iyi morfolojili  spermlerin sayısının arttırılmasıdır.

Ejakülattaki (meni) sperm hücresinin seminal plazmadan hızlı ve etkin bir şekilde uzaklaştırılması açısından sperm yıkama yöntemleri büyük önem taşır.Spermlerin seminal plasmadan uzaklaşması, kapasitasyon ve fertilizasyon için gerekli akrozomal reaksiyonun başlaması için ön koşuldur. Sperm yıkama teknikleri basit yüzdürmeden (direkt swin-up) gelişmiş dansite gradient yöntemlerine kadar çok çeşitli modifikasyonlar ile kullanılabilir.

-SWİM UP

Bilinen en eski yöntemlerden olup normospermik olgularda   standart   olarak   kabul edilmektedir.  Sperm Rise olarak da tanımlanmış olup self   (aktif)  migrasyon esasına dayanır. İşlemin kolay olup,   ucuz ekipman gerektirmesi avantajları arasında sayılabilir.   Sperm basit yıkama yöntemi ile tüp dibinde hazırlandıktan sonra üzerine kültür solüsyonu ilave edilir. Hareketli spermler bu media içinden yukarıdaki katmana yüzer.  Üst kısımdan alınan spermler yardımcı üreme tekniklerinde sırasında kullanılır.   Swim up ile bol miktarda progresif hareketli sperm elde edilebilmesine rağmen,   sperm sayısında önemli ölçüde düşüş olur,   bu nedenle şiddetli erkek faktöründe kullanımı kısıtlı kalmaktadır. Ayrıca işlem süresinin uzun olması ve viskoz ejakülatlarda iyi sonuç vermemesi de kısıtlamalar getirmektedir.

-SWİM DOWN

Ejakülat,  dansitesi seminal sıvıdan daha fazla olan bir solüsyon üzerine konularak 30-60 dakika 370 C’de 45 derece eğimde %5 CO2’li ortamda inkübe edilir, tüpün en altından 0.5cc aspire edilerek yardımcı üreme tekniklerinde kullanılır.  Basit olması ve santrifüj kullanılmaması avantajı olup progresif hareketli sperm elde etme şansı çok azdır.   Bu yöntem içerisinde albümin gradientleri de kullanılmaktadır.

-DANSİTE GRADİENT

Gradient metoduna dayanan bir ayırma-yıkama işlemidir. Silan kaplı kollaidal silika partikül solüsyonunun kültür solüsyonu (Sperm washing Medium-Flush) ile dilüe edilerek hazırlanan farklı fazların içerisinden santrifüj etkisi ile spermlerin ayrılması esasına dayanır.

İzotonik bir solüsyon olan Silan kaplı kollaidal silika partikül solüsyonu Sperm Washing Medium yada Flush Medium ile dilüe edilerek farklı gradientler halinde kullanıldığı gibi genellikle çift gradient halinde de kullanılmaktadır. Gradyenler tek tabaka (%80), iki tabaka (%40-%80) veya üç tabakalı (%30-%50-%80) olabilir. Ejakülatın özelliklerine göre gradyen metodu değişebilir.

Gradient yöntemlerinde, spermler partiküllerin arasından aşağıya doğru yüzerek dipte toplanırlar, yani sadece gravidite değil spermatozoanın kendi motilitesi de sperm seçiminde etkili olur. Gradient yönteminde gradient solüsyonları üzerine sperm konulduktan sonra uygulanacak santrifüjün süresi ve hızı çok önemlidir. Öncelikle motil olan spermler dipte toplanacağından, sürenin uzaması halinde nonmotil hücreler ve debrisler de dipte birikeceklerdir.

Gradient uygulamasının dezavantajları fazla zaman alması, mediumun pahalı olması ve seçilmiş spermlerden silika partiküllerini ayırmak için yeniden yıkama ve santrifüj gerektirmesidir.

-MİNİ GRADİENT YÖNTEMİ

Özellikle düşük sperm sayısına sahip erkeklerde kullanılan bu yöntem, daha az miktarda semenle en kaliteli spermleri seçmeyi amaçlar..Sayısı çok düşük ve şekil bozukluğu yüksek seviyede olan semen örneğinden mikroenjeksiyon(ICSI) için kullanılabilecek iyi kalitede sperm elde edilebilmesine olanak sağlayan bir yöntemdir. Bu yöntem daha çok testisten sperm elde edildiği durumlarda hazırlık amacıyla uygulanır.

Aynı zamanda sperm sayısının ileri derecede düşük olduğu ve/veya morfolojik bozukluğun yüksek seviyede olduğu durumlarda mikroenjeksiyon için kullanılabilecek iyi kalitede sperm elde edilebilmesine olanak sağlayan bir yöntemdir.

Cerrahi yöntemler ile(Mic-TESE/TESA) testisten elde edilen spermlerin hazırlığında tercih edilen bir sperm hazırlama yöntemidir.

KALİTELİ SPERMİN SEÇİMİNDE GÜNCEL YÖNTEMLER

Sperm yıkama yöntemlerinde  spermin motilite ve morfoloji özelliklerine göre seçim yapılmaktadır. Ayrıca sperm yıkama da kullanılan santrifüj yapmanın sperm DNA parçalanmasına neden olabilecek reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumunu artırdığı ve bunun da sperm fonksiyonunu ve dolayısıyla döllenmeyi ve embriyo gelişimini olumsuz etkileyebileceği gösterilmiştir. Bu noktadan yola çıkılarak, yeni sperm seçim yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmuştur. Geliştirilen tüm bu yöntemlerde amaç; IVF ya da ICSI sırasında olgun, apopitotik olmayan, DNA’sı bütün, morfolojik olarak normal spermi seçmek, semen hazırlamayı basitleştirmek ve santrifüj kullanımından kaçınmaktır.

Geliştirilen yeni seçim yöntemleri ;

– MACS (MANYETİK-AKTİVE SORTİNG SYSTEM): MACS, hücreleri belirli özelliklere göre seçici olarak izole etmek ve ayırmak için manyetik alanlardan yararlanma ilkesine göre çalışır. Hücre hasarı veya ölümü (apoptozis) belirtileri göstermeyen ve dolayısıyla tüm DNA’sını sağlam olan spermlerin seçilmesine olanak tanıyan bir immünomanyetik tekniktir.

–IMSI (INTRACYTOPLASMİC MORPHOLOGİCALLY SELECTED INJECTİON): Sperm için standart ICSI değerlendirmeleri genellikle 300–400 kat büyütmede gerçekleşirken, IMSI spermi 6000 kata kadar büyütmelerde değerlendirir. Bu sperm hücre yapısının daha kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.

-SPERM CHİP (MİCROAKIŞKAN SPERM AYIKLAMA ÇİPİ): Doğala en yakın sperm seçim yöntemi olan bu yöntem, servikal kanallardan spermlerin geçişi esas alınarak hazırlanmıştır. DNA kalitesi ve fizyolojisi en iyi spermleri mikro kanallardan geçip ayrı bir haznede toplanması esasına dayanır.

-PICSI(PHYSİOLOGİC İNTRACYTOPLASMİC SPERM İNJECTİON): Bu yöntem sperm hücrelerinin vücutta doğal bir bileşik olan hyaluronik asit adı verilen bir maddeye bağlanabilme özelliğine göre seçiminin yapılması esasına dayanmaktadır. Hyaluronik asit normalde yumurtanın çevresinde bulunan bir madde olup sadece olgun spermler tarafından tanınır ve tutunmaları sağlanır.

Bu güncel ileri sperm seçimi tekniklerinden herhangi birinin rutin uygulamada kullanılmasının önerilip önerilemeyeceğini değerlendirmek için, tanımlanan devam eden çalışmalardan beklenen veriler de dahil olmak üzere daha fazla yüksek kaliteli çalışmaya ihtiyaç vardır.