DÖLLENME (FERTİLİZASYON)

Yumurta kültürü ve sperm hazırlanması tamamlandıktan sonra döllenme safhasına geçilir. Döllenme standart tüp bebek (in vitro fertilizasyon; IVF) veya mikroenjeksiyon (intrasitoplazmik sperm injeksiyonu; ICSI) ile sağlanır. Tüp bebek ve ICSI’nin tek farkı dölleme safhasıdır; bunun dışında tüm basamaklar tamamıyla aynıdır.
ICSI’de farklı olarak laboratuar aşamasında yumurtaların spermatozoa ile birleştirilmesi değişik bir teknikle gerçekleştirilmektedir. IVF’te her yumurta yaklaşık 100.000 sperm ile bir araya getirilmekte, ancak bir tanesi kendiliğinden yumurta dış zarını aşarak içine girmekte ve onu döllemektedir. Buna karşılık, Mikro-Enjeksiyon veya ICSI’de her bir yumurtanın içine önceden belirlenen tek bir sperm hücresi bir iğne yardımıyla enjekte edilmektedir. Böylece kapasitasyon, hiperaktivasyon, zona pellucida ve oolemmanın tanınması ve geçilmesi safhaları ICSI de atlanmış olur.

• TÜP BEBEK (IVF)

Klasik tüp bebekte  inseminasyon ve oosit –embriyo kültürü için geniş hacim kültürü ve damlacık (droplet) kültürü olarak adlandırılan yöntemler kullanılabilir. İnseminasyon yapılırken Damlacık kültüründe her damlacığa bir oosit (yumurta) konulurken hacim kültüründe her bölüme 3-4 oosit(yumurta) konulmaktadır.

İnkübasyon süresi sonrası oositler uygulanacak tüp bebek tekniğinin özelliklerine göre inseminasyon yapılacağı kültür ortamına aktarılır. Her yumurtanın etrafına genellikle 50 000-100 000 motil sperm içeren damlacık bırakılarak sperm ve yumurtaların bir araya gelmesi sağlanır. Eğer sperm örneği motilite ve ve morfoloji yönünden suboptimal değerler taşıyorsa 500 000 motil sperm /ml.ye kadar artırabilmektedir. Döllenme için 1-2 saat ve ya bir gece beklenir.

Döllenme sırasında bir spermatoza oositi (yumurtayı) çevreleyen dış tabaka corona radiata ve zona pellucida tabakaları aşarken dış kılıfı ve kuyruk kısmı dışarda kalmaktadır. Sadece spermatozoa’nın genetik materyalini taşıyan çekirdek kısmı yumurtanın sitoplâzmasına alınmaktadır. Doğal yollarla veya IVF’te sperm ve yumurta birleşmesi bu şekilde olmakta bir spermatozoa ile birleşen yumurtanın bu aşamadan sonra dış zarı kalkan görevi görmekte, ikinci bir spermatozoa yumurta içine girememektedir.

Laboratuvarların bir kısmı döllenme için 1-2 saatlik süreyi yeterli bulurken bir kısmı da gece boyu inseminasyanu tercih edebilmektedir.1-2 saat veya uzun süre inkübe olan oositer mekanik denüdasyon ile kumuluslarından temizlenerek yeni kültür ortamına geçirilir.
Uzun süre veya 1-2 saat inkübe olan oositler(yumurtalar)  inseminasyondan 16-18 saat sonra fertilizasyon(döllenme) açısından değerlendirilir. Mikroskobik değerlendirme ile başarıyla döllenen yumurtalar diğer yumurtalardan ayrılır. Başarı ile döllenen yumurtalar mikroskop altında iki çekirdek (2PN) oluşturdukları gözlenir. Döllenme işleminin gerçekleşmediği yumurtalarda çekirdek gözlenmez (0 çekirdek; 0 PN) .Hatalı döllenen yumurtalar mikroskop ile yapılan değerlendirmede tek çekirdek (1 PN) ve ya üç çekirdek (3 PN) olarak ayırt edilirler.

• ICSI

Elde edilen yumurtaların kümülüs hücreleri enzimatik (hyalüronidaz) yol ile uzaklaştırılır. Stereomikroskop altında korono radyata tabakası pastör pipet ile mekanik olarak ayrılır. Oositler matürasyon derecelerine göre değerlendirilip defalarca yıkandıktan sonra 25 µl medyum ile oluşturulan damlacıklar içine konularak injeksiyona kadar inkübatörde saklanır. İnjeksiyon metafaz II yumurtalara uygulanır.

​ICSI uygulamasında yumurtaları tutmaya çalışan holding pipet ile sperm injeksiyonun gerçekleştirildiği pipetler kullanılmaktadır. Her iki pipete petri kutusunda kolay çalışabilmek için 30 derecelik açı verilir.

Sperm injeksiyonu 37 derece ısı ortamında invert mikroskop altında hidrolik mikromanüplatörle ile gerçekleştirilir. İnjeksiyon pipetine daha önceden hareketsizleştirilen tek bir sperm kuyruğundan çekilerek kıvrım yaptırmadan alınır. Metafaz II yumurta polar cisim saat 12 veya 6 hizasına gelecek şekilde injeksiyon pipetinin yardımı ile tutucu bipet tarafından sabitleştirilir. Saat 3 hizasından sperm dikkatli bir şekilde sitoplâzma içerisine yerleştirilir.3–4 oosit injekte edildikten sonra nunc-welle veya centre welle içinde inkübatöre yerleştirilerek işleme devam edilir. 16-20 saat sonra döllenme değerlendirilir.